В иммуноферментном анализе применяют ферменты, которые могут связывать антитела или антигены, меняют окраску специального хромогенного субстрата при взаимодействии с ним и могут быть зарегистрированы физико-химическим методом (методом спектрофотометрии, флуориметрическим, люминисцентным и др.).
Фермент – это сложное органическое вещество, вырабатываемое живой клеткой, способствующее различным химическим реакциям, происходящим в организме.
Хромогенный субстрат – это вещество белковой природы, приобретающее определенную окраску после расщепления специфическим протеолитическим ферментом.
Фотометрический анализ - метод качественного и количественного анализа, основанный на избирательном поглощении инфракрасного, видимого или ультрафиолетового излучения молекулами определяемого компонента или его соединения с соответствующим реагентом.
При проведении иммуноферментного анализа в качестве твердой фазы используется поверхность лунок полистиролового планшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы известные антитела (против определяемого антигена).
В лунку вносят исследуемую сыворотку крови. При наличии искомого антигена он соединяется с антителом, и образуются комплексы. Лунки промывают и удаляют не связавшиеся компоненты. В лунки вносят антитела к искомому антигену, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к предыдущему комплексу и также остаются на стенках. Затем в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (ортофенилендиамин). Если в исследуемой жидкости был антиген, фермент взаимодействует с перекисью водорода и разлагает его. Выделившийся при этом кислород окрашивает хромоген в желтый цвет. По интенсивности окрашивания, возникающего в результате реакции фермента и субстрата, можно судить о количестве антигенов.
По аналогичной схеме работают тест-системы для определения антител, но в качестве иммуносорбента в них используются антиген, а раствор, который добавляют, содержит раствор антигенов, меченых ферментом.
Метод ИФА может применяться для диагностики:
1. Вирусных заболеваний:
◦ ВИЧ-инфекции;
◦ вирусных гепатитов;
◦ цитомегаловирусной инфекции;
◦ вируса Эпштейн-Барр;
◦ герпетической инфекции;
◦ коронавирусной болезни.
2. Для диагностики инфекций, передающихся половым путем:
◦ сифилиса;
◦ хламидиоза;
◦ трихомониаза;
◦ гонореи;
◦ уреаплазмоза.
3. Уровня гормонов в эндокринологии.
4. Аутоантител и маркеров онкологических заболеваний в онкологии.
5. Общего IgE и специфических IgE антител в аллергологии.
6. Лекарственных препаратов, наркотиков в биологических образцах.
7. Белков сыворотки крови (ферритина, фибронектина и др.).
Подготовка к процедуре
Взятие пробы для лабораторного исследования методом ИФА должно проводиться:
• желательно с 7 до 9 часов утра;
• натощак, т.е. через 8-12 часов после последнего приема пищи;
• после воздержания от алкоголя не менее 24 часов;
• до проведения диагностических и лечебных процедур;
• в ряде случаев следует учитывать фазу менструального цикла, фармакодинамику лекарственных препаратов, циркадные ритмы.
Преимущества иммуноферментного анализа по сравнению с другими методами определения антигенов и антител:
• высокая чувствительность (ИФА может обнаруживать одиночные молекулы анализируемого вещества);
• возможность использования минимальных объемов исследуемого материала;
• стабильность всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА при хранении;
• простота проведения реакции;
• возможность автоматизации всех этапов реакции;
• относительно низкая стоимость диагностических наборов.
Иммуноферментный анализ может давать ложноположительный результат:
• при наличии ревматоидного фактора в крови, который является антителом против собственных IgG;
• при различных системных заболеваниях;
• при нарушениях обменных процессов в организме;
• при приеме некоторых лекарственных препаратов;
• у новорожденных детей.